技術(shù)文獻(xiàn)
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硝酸纖維素膜注意事項(xiàng):
1) 由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過(guò)程，建議樣品在染色后1小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析。
2) 對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，PI攝入過(guò)多；消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合。消化時(shí)將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時(shí)胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會(huì)影響Annexin V與PS的結(jié)合。
3) 實(shí)驗(yàn)中如需要固定細(xì)胞，比如在檢測(cè)凋亡的同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞周期，只能選用Annexin V-FITC，而不能選用Annexin V-EGFP，因?yàn)樵诠潭ㄟ^(guò)程中EGFP會(huì)變性導(dǎo)致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細(xì)胞與Annexin V-FITC進(jìn)行孵育，并用binding buffer洗掉未結(jié)合的Annexin V-FITC。因?yàn)楣潭ㄟ^(guò)程中細(xì)胞通透性增加會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞碎片，可以和Annexin V結(jié)合，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。
4) 如果樣品來(lái)源于血液，請(qǐng)務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴蠵S，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。
5) 試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。
1) 由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過(guò)程，建議樣品在染色后1小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析。
2) 對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，PI攝入過(guò)多；消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合。消化時(shí)將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時(shí)胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會(huì)影響Annexin V與PS的結(jié)合。
3) 實(shí)驗(yàn)中如需要固定細(xì)胞，比如在檢測(cè)凋亡的同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞周期，只能選用Annexin V-FITC，而不能選用Annexin V-EGFP，因?yàn)樵诠潭ㄟ^(guò)程中EGFP會(huì)變性導(dǎo)致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細(xì)胞與Annexin V-FITC進(jìn)行孵育，并用binding buffer洗掉未結(jié)合的Annexin V-FITC。因?yàn)楣潭ㄟ^(guò)程中細(xì)胞通透性增加會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞碎片，可以和Annexin V結(jié)合，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。
4) 如果樣品來(lái)源于血液，請(qǐng)務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴蠵S，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。
5) 試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光。
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